miRNA芯片
许多疾病，包括癌症，往往可以被看做是由基因表达错乱所引起的。据估计，30％以上的编码基因翻译成蛋白质都是由miRNA调控。越来越多的证据也表明，miRNA与信号网络中调控可变剪切事件的长链非编码RNA相互作用，从而影响了凋亡、增殖和分化等细胞过程。所有这一切都可能成为各种疾病（比如癌症）的致病因素。检测这些关键调控节点的变化对于研究差异表达的生物学背景非常重要。miRNA4.0是一个强大的工具，有助于研究非编码RNA的作用及其在发育生理机制中的参与程度。
miRNA芯片介绍
Affymetrix miRNA 4.0 芯片全面覆盖Sanger miRBase V20.0数据库，同时检测206个物种的miRNA。同时检测成熟miRNA和miRNA前体（仅限人、小鼠、大鼠），能检测人snoRNA和scaRNA。这是一款唯一能同时检测成熟miRNAH和前体miRNA的芯片检测工具。
其中，人、小鼠、大鼠的具体检测参数如下：
芯片优势
• 物种涉及面广：一张芯片可同时检测206个物种的miRNA信息。
• 最新注释数据：全面覆盖Sanger miRBase V20.0数据库，可同时检测成熟miRNA和miRNA前体（仅限人、小鼠、大鼠），也能检测人snoRNA和scaRNA。
• 高探针覆盖度：每个miRNA至少覆盖有20条探针 ，其中特殊茎环探针可特异性检测pre-miRNA。
• 样品要求低：最低上样量只需100ng总RNA ，表达丰度低的血浆、血清、体液、外泌体等亦可检测。
芯片注释数据库：
Sanger miRBase 20.0数据库收录了来自约40篇新文献报道的3355条新的发夹前体序列和5393条新的成熟体microRNA，miRNA 发夹前体序列已升至 24521 条；成熟 miRNA 序列升至 30424 条。其中新增成熟 miRNA 中，人成熟的 miRNA 增至 2578 条（新增536条），小鼠成熟的 miRNA 增至 1908 条（新增627条），大鼠 miRNA 增至 728 条。其它物种，Gallus gallus [鸡]新增205条, Solanum tuberosum[马铃薯]新增332条，Populus trichocarpa [毛果杨]新增32条，Linum usitatissimum[亚麻]新增124条（亚麻为新增物种）。此外，还新增了一系列物种的miRNA序列，包括Ictalurus punctatus [斑点叉尾鮰]，Branchiostoma belcheri[文昌鱼]，Avicennia marina[白骨’壤]，Prunus persica[碧桃]，Duck enteritis virus [鸭肠炎病毒]等。
服务特色
• 增加 miRNA和mRNA之间的关联分析信息（在annotation file里增加相应的内容）。
• 为客户整合推出miRNA 芯片分析全面解决方案（包括归一化、差异基因筛选、miRNA靶基因预测、 miRNA与靶基因网络图、miRNA-GO Network、miRNA-Pathway Network、miRNA的转录因子的预测、miRNA与表达谱芯片平台的联合分析）。
芯片注释数据库：
Sanger miRBase 20.0数据库收录了来自约40篇新文献报道的3355条新的发夹前体序列和5393条新的成熟体microRNA，miRNA 发夹前体序列已升至 24521 条；成熟 miRNA 序列升至 30424 条。其中新增成熟 miRNA 中，人成熟的 miRNA 增至 2578 条（新增536条），小鼠成熟的 miRNA 增至 1908 条（新增627条），大鼠 miRNA 增至 728 条。其它物种，Gallus gallus [鸡]新增205条, Solanum tuberosum[马铃薯]新增332条，Populus trichocarpa [毛果杨]新增32条，Linum usitatissimum[亚麻]新增124条（亚麻为新增物种）。此外，还新增了一系列物种的miRNA序列，包括Ictalurus punctatus [斑点叉尾鮰]，Branchiostoma belcheri[文昌鱼]，Avicennia marina[白骨’壤]，Prunus persica[碧桃]，Duck enteritis virus [鸭肠炎病毒]等。
服务特色
• 增加 miRNA和mRNA之间的关联分析信息（在annotation file里增加相应的内容）。
• 为客户整合推出miRNA 芯片分析全面解决方案（包括归一化、差异基因筛选、miRNA靶基因预测、 miRNA与靶基因网络图、miRNA-GO Network、miRNA-Pathway Network、miRNA的转录因子的预测、miRNA与表达谱芯片平台的联合分析）。
miRNA芯片实验流程
miRNA芯片分析流程
miRNA芯片分析流程
RNA样本
1. Total RNA>6ug（真核）；＞10ug（原核）。
2. 260/280在1.8-2.1之间。
3. 凝胶电泳28S跟18S要清晰可见，并且弥撒不能严重。
4. RNA浓度>250ng/ul。
组织样本
（建议重量>100mg） 推荐两种保存运输方法，任选其一：
A. 获得新鲜的组织样本后，在RNase-free的0.9%生理盐水中漂洗样本，除去血渍。装入冻存管，旋上盖子，迅速投入液氮冷却1~2小时,然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
B. 获得新鲜的组织样本后，立即剪成所有方向都< 0.5 cm的小块，整个浸没在5倍体积的RNAlater中，4°C浸泡过夜，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
细胞样本
贴壁细胞：
1. 去除培养液。
2. 按10cm2 培养面积加1ml的比例加入Trizol（invitrogen公司）。 3. 用1ml枪头反复吹打，使Trizol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化。 4. 转移到RNase-free的试管中反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应为清亮而不粘稠的状态。 5. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
悬浮细胞：
1. 悬浮细胞培养结束后离心去除培养液。
2. 保留的细胞用PBS缓冲液快速洗一次，离心出去PBS缓冲液。
3. 按照每5*106 个细胞加1ml Trizol的比例加入Trizol试剂，反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态。
4. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
血液样本
1. 血清/血浆处理 全血样本(体积>2ml全血)收集后，离心收集血浆/血清(无纤维蛋白原)，然后加入3倍体积的TRIzol LS，混匀后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
2. 全血 推荐4种保存运输方法，任选其一：
A. 用PAXgen RNA采血管，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。详细流程请参阅PAXgen说明书。
B. 外周血样本用3倍体积的TRIzol LS处理获得裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
C. 从外周血分离白细胞，用TRIzol LS处理成裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。请参阅TRIzol LS说明书。
D. 用TIANGEN RNALock血液RNA稳定剂，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
1. Total RNA>6ug（真核）；＞10ug（原核）。
2. 260/280在1.8-2.1之间。
3. 凝胶电泳28S跟18S要清晰可见，并且弥撒不能严重。
4. RNA浓度>250ng/ul。
组织样本
（建议重量>100mg） 推荐两种保存运输方法，任选其一：
A. 获得新鲜的组织样本后，在RNase-free的0.9%生理盐水中漂洗样本，除去血渍。装入冻存管，旋上盖子，迅速投入液氮冷却1~2小时,然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
B. 获得新鲜的组织样本后，立即剪成所有方向都< 0.5 cm的小块，整个浸没在5倍体积的RNAlater中，4°C浸泡过夜，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
细胞样本
贴壁细胞：
1. 去除培养液。
2. 按10cm2 培养面积加1ml的比例加入Trizol（invitrogen公司）。 3. 用1ml枪头反复吹打，使Trizol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化。 4. 转移到RNase-free的试管中反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应为清亮而不粘稠的状态。 5. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
悬浮细胞：
1. 悬浮细胞培养结束后离心去除培养液。
2. 保留的细胞用PBS缓冲液快速洗一次，离心出去PBS缓冲液。
3. 按照每5*106 个细胞加1ml Trizol的比例加入Trizol试剂，反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态。
4. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
血液样本
1. 血清/血浆处理 全血样本(体积>2ml全血)收集后，离心收集血浆/血清(无纤维蛋白原)，然后加入3倍体积的TRIzol LS，混匀后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
2. 全血 推荐4种保存运输方法，任选其一：
A. 用PAXgen RNA采血管，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。详细流程请参阅PAXgen说明书。
B. 外周血样本用3倍体积的TRIzol LS处理获得裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
C. 从外周血分离白细胞，用TRIzol LS处理成裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。请参阅TRIzol LS说明书。
D. 用TIANGEN RNALock血液RNA稳定剂，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
miRNA芯片分析流程
案例一 ：miRNA Let-7i抑制心脏炎症和纤维化
血管紧张素II刺激成纤维细胞的增殖，进一步改变基因表达模式，从而导致心脏重塑，但这种差异机制是未知的。miRNA是一种调节基因表达的新机制。在这里，我们使用基因芯片检测小鼠心脏中的miRNA和mRNA表达模式，研究它们在血管紧张素II诱导心脏重塑中的作用，发现let-7i作为血管紧张素II诱导心脏炎症和纤维化的新型负调节器，通过抑制白细胞介素-6和多个胶原蛋白在心脏中的表达，可能为治疗高血压心肌纤维化提供新的潜在治疗靶标。
整个实验分为三组：Saline组、Ang II 3D组、Ang II 7D组，每组3个重复，分别收集相应的心脏组织。利用miRNA芯片检测miRNA水平。
为了从数据中筛选出核心的miRNA及其靶标做进一步研究，作者以同样的分组同样的样品又做了一篇转录组数据（Affymetrix Mouse 430 array），并利用生物信息学（这里主要采用的MicroRNA Target gene Network分析工具），发现let7i处于比较核心的位置，且它的靶标与心肌炎症和纤维化密切相关，这预示着let7i在心脏重塑中发挥重要作用。
案例二 miRNA-384-5p通过靶向PIK3CD调节缺血诱导的心脏保护
miRNA（mi RNA）是一类新型强大的，内源性基因表达调节剂。本研究使用Taq Man低密度阵列鉴定大鼠缺血心肌中16种差异表达的miRNA。此外，应用生物信息学分析如功能和通路富集分析来确定凋亡通路，仅通过miR-384-5p和所有相关的靶基因（PIK3CD，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1，CASP3和IL1A）。除了PIK3CB外，这些靶基因通过qRT-PCR测定显示显着上调，这进一步表明PIK3CD，PPP3CA，PPP3R1，CASP3，IL1A可以通过miR-384-5p调节。 MTT，蛋白质印迹，qRT-PCR和荧光素酶测定用于调查miR-384-5p在心肌缺血中的作用。我们发现caspase3表达由miR-384-5p上调，并通过miR-384-5p抑制剂下调，表明凋亡途径由miR-384-5p调节。我们还发现miR-384-5p抑制细胞活力，而miR-384-5p抑制剂改善它，确认H9c2细胞存活受miR-384-5p影响。此外，H9c2细胞中的PIK3CD蛋白水平被miR-384-5p抑制剂上调。我们发现miR-384-5p表达水平降低，PIK3CD蛋白水平在大鼠缺血心肌和缺氧H9c2细胞中增加，并且miR-384-5p通过mi R-384-5p结合位点抑制PIK3CD表达3'非翻译区。这些结果表明miR-384-5p，一个重要的保护因子，通过调节PIK3CD在心肌缺血中发挥重要作用的心脏保护。
miRNA Target Gene Network
miRNA Target GO Network
血管紧张素II刺激成纤维细胞的增殖，进一步改变基因表达模式，从而导致心脏重塑，但这种差异机制是未知的。miRNA是一种调节基因表达的新机制。在这里，我们使用基因芯片检测小鼠心脏中的miRNA和mRNA表达模式，研究它们在血管紧张素II诱导心脏重塑中的作用，发现let-7i作为血管紧张素II诱导心脏炎症和纤维化的新型负调节器，通过抑制白细胞介素-6和多个胶原蛋白在心脏中的表达，可能为治疗高血压心肌纤维化提供新的潜在治疗靶标。
整个实验分为三组：Saline组、Ang II 3D组、Ang II 7D组，每组3个重复，分别收集相应的心脏组织。利用miRNA芯片检测miRNA水平。
为了从数据中筛选出核心的miRNA及其靶标做进一步研究，作者以同样的分组同样的样品又做了一篇转录组数据（Affymetrix Mouse 430 array），并利用生物信息学（这里主要采用的MicroRNA Target gene Network分析工具），发现let7i处于比较核心的位置，且它的靶标与心肌炎症和纤维化密切相关，这预示着let7i在心脏重塑中发挥重要作用。
案例二 miRNA-384-5p通过靶向PIK3CD调节缺血诱导的心脏保护
miRNA（mi RNA）是一类新型强大的，内源性基因表达调节剂。本研究使用Taq Man低密度阵列鉴定大鼠缺血心肌中16种差异表达的miRNA。此外，应用生物信息学分析如功能和通路富集分析来确定凋亡通路，仅通过miR-384-5p和所有相关的靶基因（PIK3CD，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1，CASP3和IL1A）。除了PIK3CB外，这些靶基因通过qRT-PCR测定显示显着上调，这进一步表明PIK3CD，PPP3CA，PPP3R1，CASP3，IL1A可以通过miR-384-5p调节。 MTT，蛋白质印迹，qRT-PCR和荧光素酶测定用于调查miR-384-5p在心肌缺血中的作用。我们发现caspase3表达由miR-384-5p上调，并通过miR-384-5p抑制剂下调，表明凋亡途径由miR-384-5p调节。我们还发现miR-384-5p抑制细胞活力，而miR-384-5p抑制剂改善它，确认H9c2细胞存活受miR-384-5p影响。此外，H9c2细胞中的PIK3CD蛋白水平被miR-384-5p抑制剂上调。我们发现miR-384-5p表达水平降低，PIK3CD蛋白水平在大鼠缺血心肌和缺氧H9c2细胞中增加，并且miR-384-5p通过mi R-384-5p结合位点抑制PIK3CD表达3'非翻译区。这些结果表明miR-384-5p，一个重要的保护因子，通过调节PIK3CD在心肌缺血中发挥重要作用的心脏保护。
miRNA Target Gene Network
miRNA Target GO Network
miRNA Target Pathway Network
