LncRNA检测以及功能学研究机制
lncRNA芯片分析流程
1. Total RNA>50 ng。
2. 260/280在1.8-2.1之间。
3. 凝胶电泳28S跟18S要清晰可见，并且弥撒不能严重。
4. RNA浓度>20 ng/ul。
组织样本
（建议重量>100mg） 推荐两种保存运输方法，任选其一：
A. 获得新鲜的组织样本后，在RNase-free的0.9%生理盐水中漂洗样本，除去血渍。装入冻存管，旋上盖子，迅速投入液氮冷却1~2小时,然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
B. 获得新鲜的组织样本后，立即剪成所有方向都< 0.5 cm的小块，整个浸没在5倍体积的RNAlater中，4°C浸泡过夜，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。详细操作流程请参阅RNAlater说明书。
细胞样本
贴壁细胞：
1. 去除培养液。
2. 按10cm2 培养面积加1ml的比例加入Trizol（invitrogen公司）。 3. 用1ml枪头反复吹打，使Trizol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化。 4. 转移到RNase-free的试管中反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应为清亮而不粘稠的状态。 5. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
悬浮细胞：
1. 悬浮细胞培养结束后离心去除培养液。
2. 保留的细胞用PBS缓冲液快速洗一次，离心出去PBS缓冲液。
3. 按照每5*106 个细胞加1ml Trizol的比例加入Trizol试剂，反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态。
4. 液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
血液样本
1. 血清/血浆处理 全血样本(体积>2ml全血)收集后，离心收集血浆/血清(无纤维蛋白原)，然后加入3倍体积的TRIzol LS，混匀后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
2. 全血 推荐4种保存运输方法，任选其一：
A. 用PAXgen RNA采血管，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。详细流程请参阅PAXgen说明书。
B. 外周血样本用3倍体积的TRIzol LS处理获得裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
C. 从外周血分离白细胞，用TRIzol LS处理成裂解液，然后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。请参阅TRIzol LS说明书。
D. 用TIANGEN RNALock血液RNA稳定剂，混匀之后液氮保存或转移至-80°冰箱保存。
案例一 lncTCF7在肝癌干细胞自我更新中的调控作用
中国科学院生物物理所的范祖森研究员带领的研究小组于2015年8月31日在国际学术期刊《Journal of clinical investigation》上在线发表了一项名为<ZIC2-dependent OCT4 activation drives self-renewal of human liver cancer stem cells>的最新研究论文，首次报告了他们在肝癌干细胞(liver CSCs)中发现转录因子ZIC2的高表达，并且这一效应对维持肝癌干细胞自我更新的作用机制起到了重要的作用。在本研究中，经转录组芯片（Affymetrix HTA 2.0）分析，我们确定了一个长链非编码RNA（lncRNA），命名为lncTCF7，它在肝癌肿瘤和肝脏CSCs中高度表达。 LncTCF7是肝脏CSC自我更新和肿瘤增殖所必需的。研究发现lncTCF7招募SWI / SNF复合物到TCF7的启动子区域以调节其表达，从而导致Wnt信号传导的激活。我们的数据表明lncTCF7介导Wnt信号通路启动肝脏CSC自我更新和肿瘤增殖。因此，总结来讲， lncRNA通过调节 Wnt信号通路，促进肝癌干细胞的致瘤活性，进一步突出了lncRNAs在肿瘤生长和增殖中的作用。
案例二 喉鳞状细胞癌lncRNA和mRNA表达谱的综合分析
长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤发生中起重要作用。然而，喉鳞状细胞癌（LSCC）中lncRNA的表达模式和功能尚不清楚。为了研究晚期LSCC中异常表达的lncRNA和m RNA，我们通过lncRNA和mRNA整合芯片（Affymetrix HTA 2.0）对9对原发性IVA阶段LSCC组织和相邻非肿瘤组织进行高通量检测。研究通过功能和通路富集分析， 发现差异mRNA参与的重要功能和通路。接着构建全局信号网络图和ceRNA网络，筛选出核心mRNA，而lncRNA-m RNA共表达网络识别lncRNA和mRNA之间的相互作用。 qRT-PCR进一步验证晚期LSCC中lncRNA和mRNA的表达。我们发现1459个差异lncRNA和2381个差异mRNA， 包括846个上调的lncRNA和613个下调的lncRNAs，1542个上调mRNA和839个下调mRNA。通过数据分析我们筛选出3个核心基因： ITGB1，HIF1A和DDIT4，它们主要参与生物过程，包括基质组织，细胞周期，粘附和代谢通路。 LncRNA-mRNA共表达分析显示LncRNA NR_027340，MIR31HG分别与ITGB1， HIF1A正相关。 LncRNA SOX2-OT与DDIT4呈负相关。 qRT-PCR进一步验证了这些lncRNA和mRNA的表达。这项工作提供了令人信服的证据，确定了lncRNA和mRNA是潜在的生物标志物，可用于晚期LSCC进一步研究。
案例三 人的鼻窦鳞状细胞癌中长非编码RNA的表达研究
本研究旨在确定鼻窦鳞状细胞癌（SSCC）异常表达的长非编码RNA（lncRNAs），并探索其潜在功能。方法：我们对6个SSCC及成对的相邻非癌组织进行lncRNA和mRNA表达检测（Affymetrix HTA 2.0）。利用功能和通路富集分析来研究基因功能，并描述了基因信号网络和lncRNA-mRNA共表达网络。利用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）来验证从另外22名患者获得的第二组配对SSCC和相邻非癌组织中的5个lncRNA表达。结果：相对于非癌组织，在SSCC我们发现显著差异表达的lncRNAs（n= 3146）和mRNAs（n = 2208）。功能富集分析表明有一些核心基因产物可能与SSCC发生有关。通路富集分析鉴定了许多与癌症相关的通路。 lncRNA-mRNA共表达网络和基因信号网络分析结果提示一些核心lncRNAs / mRNAs可能在SSCC发病机制中发挥重要作用。 qRT-PCR结果显示5种lncRNA均有差异表达，与芯片结果一致。结论：我们的研究是对SSCC lncRNA表达谱的首次筛选和分析，这可能为这种疾病的发病机制研究提供新思路。
参考文献：
1. The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self-Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling. Cell Stem Cell. 2016.
2. LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem cells . Nature communication. 2016 .
3. Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression. 2016.
4. Aberrant expression of long noncoding RNAs in chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
5. Integrated Analysis of Long Noncoding RNA and m RNA Expression Profile in Advanced Laryngeal Squamous Cell Carcinoma.
6. Aberrant Expression Profile of Long Noncoding RNA in Human Sinonasal Squamous Cell Carcinoma by Microarray Analysis.
