推荐语：肠上皮具有显著的自我更新能力，这种能力是由位于底部的肠干细胞(ISCs)中Lgr5+驱动的。然而，控制Lgr5+的分子机制还尚未参透。2018年9月17日，Nature Cell Biology在线发表了中科院生物物理研究所范祖森团队合作和田勇团队的最新成果《LncGata6 maintains stemness of intestinal stem cells and promotes intestinal tumorigenesis》，证明了长链非编码RNA(lncGata6)在ISCs中高表达。在ISCs中，LncGata6的敲除或条件敲除会损害ISCs的干细胞和上皮再生。同时，lncGata6招募NURF复合物到EHF启动子诱导其转录，促进LGR4/5的表达，增强Wnt信号的激活。此外，人源lncGATA6在结直肠癌干细胞中高表达，促进肿瘤的发生和发展。反义寡核苷酸lncGATA6对结直肠癌有较强的治疗效果，这也说明了基于lncGATA6的RNA干扰疗法未来或许在临床靶向治疗结直肠癌中具有一定的前景。

 

从鼠回肠隐窝中细胞分选获得Lgr5+细胞，进行基因芯片检测（Calriom D系列），经差异筛选得到2144个差异lncRNAs。然后，通过CRISPRi技术分别敲低上调表达前10的lncRNAs，进一步筛选，发现lncGata6下调表达对ISCs的影响最显著，并通过qPCR验证lncGata6在成熟ISCs高表达；通过过表达和shRNA干扰验证lncGata6与ISCs细胞干性维持有关。下一步，构建lncGata6RFP基因报告小鼠，对lncGata6表达进行定位研究，发现其主要分布于肠道组织，同时采用荧光原位杂交（FISH）检测到lncGata6在ISCs中表达。最后，通过以上实验筛选并验证了lncGata6在小鼠和人的ISCs中高表达。

通过初步验证lncGata6与ISCs干性维持有关后，为了进一步研究lncGata6功能。首先，作者利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得lncGata6 敲除小鼠发现，lncGata6−/−鼠与野生型鼠相比，绒毛长度和隐窝细胞减少，ISCs及其分化的细胞数目也减少；然后，通过辐射诱导肠再生实验发现，lncGata6−/−鼠肠再生能力和肠损伤修复能力受损。

以上结果发现lncGata6可以调控ISCs干性维持，影响肠再生功能，那么其作用机制是什么。因此，接下来就是找lncRNA调控的靶蛋白。首先，在lncGata6敲除后，同位点基因GATA6及邻近的相关基因表达水平没有受到显著影响，因此猜测其调控方式可能是远距离调控（即反式调控trans）。然后，通过RAP实验研究与lncGata6互作的蛋白，通过标记的与lncGata6互补的寡核苷酸，捕获肠道隐窝细胞裂解物中相互作用蛋白，通过银染分析、质谱鉴定得到，其作用的蛋白属于NURF重塑复合物中的两个亚基Bptf 和Snf2l，进一步通过Western blot实验验证。然而，在针对lncGata6−/− crypts的RAP实验中没有检测相关蛋白。下一步，预测lncGata6中4号外显子区3级结构是与Bptf因子互作的关键结构，并通过EMSA实验验证这一推测。最后，以上结果表明lncGata6的作用与Bptf的相互作用有关。

上述实验找到了lncGata6的靶蛋白，接下来研究下游信号机制。首先，对野生型 和 lncGata6Mut肠道干细胞进行基因芯片检测（Calriom D系列），经差异筛选后发现lncGata6Mut中转录因子显著下调，在下调最显著的转录因子中，利用体内CRISPR-Cas9基因编辑进行敲除后发现，Ehf-KO后Lgr5+ ISC细胞减少最显著。下一步，研究Ehf转录因子对ISCs细胞功能的调控机制，利用ChIRP实验，Ehf启动子与lncGata6有互作，进一步研究发现，lncGata6可以招募NURF复合物到Ehf启动子激活其表达。

在发现lncGata6激活Ehf启动子表达后，为了进一步研究下游Ehf调控ISCs功能的分子机制，首先建立Ehf-KO 鼠，进行基因芯片检测（Calriom D系列）和数据分析（功能富集分析+GSEA分析），发现Ehf−/− ISCs中Wnt信号通路相关基因显著下调表达，进一步通过CHIP和EMSA实验验证Ehf可以作用于Lgr4和Lgr5基因的启动子。进一步通过CRISPR-Cas9基因编辑敲除Lgr4和Lgr5基因的启动子区中Ehf结合区域，验证Ehf通过激活Lgr4和Lgr5表达进一步激活Wnt信号通路。最后进一步实验验证了“lncGata6-Bptf-Ehf”信号轴，调控Lgr4和Lgr5基因表达，从而调控ISCs细胞干性维持。

肿瘤干细胞具有自我更新能力，据报道Lgr5+ ISCs可能是小肠腺瘤和结肠癌的源细胞，因此，下一步，作者验证lncGATA6是否与肠道肿瘤发生有关，结果发现lncGATA6和Bptf在结肠肿瘤中高表达，并且在结肠癌细胞中验证了lncGATA6可以通过wnt信号通路促进肿瘤发生。接下来，通过体内实验发现lncGATA6 shRNA慢病毒可以具有显著的抗肿瘤效果，这说明了lncGATA6是潜在的治疗结肠癌的作用靶点。

参考文献：Pingping Zhu et al. LncGata6 maintains stemness of intestinal stem cells and promotes intestinal tumorigenesis. Nature cell Biology, 2018.IF=19.

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