目前，大家在DNA甲基化检测上，如检测某一个或几个基因的甲基化水平，这时采用高通量甲基化芯片或测序，通量太高，过于浪费；而采用传统的焦磷酸测序、T-BSP、MSP一次性只能检测个别甲基化位点，麻烦费事，也不合适。这时候HT-BSP应运而生，可以检测多个基因任何位置的甲基化水平，既适用于一些甲基化检测区域已知的基因，也适用于探索基因的显著甲基化区域。

HT-BSP简述

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  HT-BSP（BSP高通量测序）可一次性快速检测所有甲基化位点，是T-BSP（BSP克隆测序）的升级版，是非常理想的甲基化验证方法。与其他技术相比，HT-BSP在通量、性价比和精准性上遥遥领先，在表观遗传学研究中逐渐成为甲基化检测的优势方法。首先用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后在CpG岛两端设计引物进行PCR，将目的产物纯化后，构建PCR文库并测序，然后进行高通量测序，最后将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。

 
HT-BSP实验流程

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1.    基因组DNA提取和定量
2.    亚硫酸氢钠处理（包括纯化和脱碘基反应）使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
3.    处理后的DNA纯化回收
4.    根据目的基因启动子序列设计相应引物，使用优化过的BSP引物进行PCR扩增
5.    PCR产物高通量测序
6.    数据分析，发掘每个CpG位点的甲基化信息
 

 

 HT-BSP和T-BSP比较

 

 

HT-BSP案例展示

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目的：检测基因BDNF的甲基化水平！
第一步：样本DNA提取及质控
        共有6个血液样品，样本名称参照管上的原始编号（3: 3混样）。
        B190-1(病例)、B190-2（对照）以下分别简称“样品1”、“样品2”， 测试基因共10个片段（具体检测片段数量以最终引物设计后为准！）。  
第二步：查询基因BDNF的CpG岛
          在UCSC中查询，结果发现4个CpG岛，多位于BDNF基因上游及内部，有检测意义。


 
        1、CpG: 80，基因组位置chr11:27700115-27701092，978bp。  分3段检测
        2、CpG:54，  基因组位置chr11:27719098-27719618 ，521bp。分2段检测
        3、CpG:14， 基因组位置chr11:27720513-27720726 , 214bp。   分1段检测
        4、CpG:81， 基因组位置chr11:27721926-27723017，1092bp。 分4段检测
 

第三步：引物设计（以CpG：54为例）
              >hg38_cpgIslandExt_CpG: 54 range=chr11:27718898-27719818 5‘pad=200 3’pad=200 strand=+ repeatMasking=none（加粗斜体下划线部分为引物位置）

 

第四步：亚硫酸盐处理及PCR扩增
             1.严格按照试剂盒说明书操作，取基因组DNA 1ug进行亚硫酸盐转化并纯化回收。
             2.PCR扩增
             3.切胶回收
 
第五步：Illumina 建库和测序
    1. PCR产物检测合格后，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化等步骤完 成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度 ＞2nM），以保证文库质量。文库构建原理图如下：     2. 上机测序
        库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。
 
第六步：下机数据分析
 1. 下机原始数据，经过去除低质量数据之后，采用perl 脚本结合PCR引物5’段barcode 序列将文库信息分离到对应样品。分离样品统计如下：  
2. 甲基化水平分析
    通过计算甲基化状态序列/(甲基化状态序列+非甲基化状态序列)得到甲基化比例，并计算出两组的差异甲基化水平（Diff_meth=实验组甲基化比例-对照组甲基化比例），当差值>0.1（即百分之十）时，认为该CG位点存在甲基化差异。为了全面直观的展示样品之间的目的基因甲基化水平，做无监督聚类分析，以热图形式显示。
 
3. 目的基因待测片段中 CG位点的甲基化点状图
点状图是展示甲基化的经典方法，白色空心点表示未发生甲基化的CG位点，黑色实心点表示发生甲基化的CG位点。