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科研动态

文献解读 | miR-154-5p通过靶向CUL2抑制宫颈癌变中的

来源：小博发布时间：2020-07-29

题目：MicroRNA-154-5p regulates the HPV16 E7-pRb pathway in Cervical Carcinogenesis by targeting CUL2

客户单位：山西医科大学
中康博提供：

  1. 基因芯片检测（Affymetrix miRNA 4.0 array）

  2. 生物信息学分析（聚类图、趋势分析、功能和通路富集分析）

 

推荐语

宫颈癌是由HPV持续感染引起的，死亡率很高。E3泛素连接酶cullin2（CUL2）是HPV16-E7介导的视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）降解的关键。miRNAs在肿瘤发生过程中发生失调，但miRNAs与宫颈癌特异性CUL2之间的关系仍然未知。本研究使用Affymetrix  miRNA芯片检测宫颈癌组织中miRNA的表达，然后通过PCR在130例活检标本中发现miR-154-5p在肿瘤进展过程中下调。生物信息学分析和双荧光素酶报告实验表明miR-154-5p直接作用于CUL2-3'UTR。为了研究miR-154-5p及其靶标CUL2的功能，构建miR-154-5p模拟物、miR-154-5p抑制剂或CUL2  siRNA转染HPV16阳性宫颈癌细胞株（SiHa），然后通过CCK8细胞计数试剂盒、伤口愈合实验和侵袭实验等实验检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力，结果发现：miR-154-5p表达增加可显著降低SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭，而miR-154-5p抑制剂则相反。CUL2沉默与miR-154-5p类似，降低SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭，同时也增加了pRb的表达。最终证明miR-154-5p通过靶向CUL2  3'UTR来调节pRb的表达，从而在HPV16-E7诱导的宫颈癌发生中发挥抑癌作用。

 

样本情况

2016年1月至2018年1月，山西医科大学第二医院共收集了130例人类宫颈活检标本，研究对象均为在山西居住5年以上的汉族人。两次病理检查证实肿瘤发生。排除白血病、肝病或其他肿瘤患者。没有病人在获得组织前接受放疗或化疗。在获得所有参与者的书面知情同意后，通过阴道镜检查子宫颈组织活检，并立即将样本保存在-80°C的冰箱中。130例人类宫颈活检标本包括：

  • HPV16+正常组：HPV16阳性正常宫颈（n=35）

  • HPV16+宫颈上皮内瘤变组：HPV16阳性CIN1（n=31）、HPV16阳性CIN2/3（n=33）、

  • HPV16+鳞状细胞癌组：HPV16阳性SCC（n=31），根据2009年国际妇产科联合会（FIGO）分期标准，Ia期12例，Ib期7例，IIa期12例。按病理分型，高分化9例，中分化20例，低分化2例。

  • 芯片检测样本：从130例患者中选择25例年龄匹配的样本。

    • 10例鳞状细胞癌组织

    • 10例CIN3组织

    • 5例正常宫颈组织

 

研究结果
不同分组宫颈组织的miRNA表达谱和数据分析

三分组：10例鳞状细胞癌组织、10例CIN3组织和5例正常宫颈组织，即癌症组、瘤变组、正常组。

通过Affymetrix miRNA 4.0芯片检测miRNA，并进行三组比较，发现共有77个miRNAs差异表达（图2A、2B）。在miRbase和TargetScan中预测77个差异表达的miRNAs的靶基因，以重叠基因作为最终数据集，最终共预测了2618个靶基因。GO富集分析确定了Wnt信号、蛋白质泛素化（特别是泛素依赖的蛋白质分解代谢过程）、转化生长因子β受体信号，以及参与调节上皮-间质转化和转录调控的基因（图2C）。此外，KEGG富集分析确定了磷脂酶D信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路，以及参与肿瘤中胆碱代谢和甘油磷脂代谢的基因（图2D）。

 

CUL2是miR-154-5p的直接靶点

生物信息学预测发现：CUL2  3'UTR可能被17个差异表达的miRNAs靶向；其中miR-154-5p的得分最高（图3A，见表3）。

 

miR-154-5p可能与CUL2上的两个区域结合（图3B），并且在不同物种之间高度保守（图3C）。这些结果表明miR-154-5p能与CUL2  3'UTR形成稳定而紧密的结合。此外，双荧光素酶报告试验表明，与NC对照相对，转染有miR-154-5p模拟质粒的细胞相对荧光素酶活性显著降低。这些结果共同证实了miR-154-5p和CUL2之间的直接结合（图3D）。

 

 

miR-154-5p抑制SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭

CIN1、CIN2/3和SCC中miR-154-5p的表达水平均低于正常宫颈，与miRNA芯片结果一致（图4A）。此外，两种人类宫颈癌细胞系（SiHa和Caski）中miR-154-5p水平也低于293T（图4B）。用miR-154-5p模拟物或miR-154-5p抑制剂转染SiHa细胞，观察其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过荧光显微镜和RT-qPCR检测miR-154-5p水平，验证转染效率。荧光显微镜检测显示所有组的转染效率都超过90%（图4C）。RT-qPCR结果显示miR-154-5p模拟转染后miR-154-5p水平显著高于模拟NC，而miR-154-5p抑制剂转染后miR-154-5p水平明显低于抑制剂NC（均P<0.001）（图4D）。与相应的NC组相比，转染miR-154-5p模拟物降低了SiHa细胞的增殖，而miR-154-5p沉默增加了细胞增殖（两者均P<0.05，图4E）。转染miR-154-5p模拟物抑制SiHa细胞迁移，而转染miR-154-5p抑制剂与转染相应的NCs相比增强了细胞迁移（均P<0.05，图4F，4G）。与相应的NC相比，转染miR-154-5p模拟物的SiHa细胞的侵袭能力下降了54.76%，而转染miR-154-5p抑制剂的SiHa细胞的侵袭能力提高了63.41%（两者P<<0.05，图4H，4I）。

 

miR-154-5p通过靶向CUL2介导pRb的表达

miR-154-5p可直接与CUL2的3'UTR结合。为了进一步阐明miR-154-5p是否会对CUL2的表达产生抑制作用，研究对转染的SiHa细胞进行了western印迹分析。转染后72小时，转染miR-154-5p模拟物的细胞中CUL2蛋白的表达低于模拟NC，而miR-154-5p抑制剂处理组的CUL2蛋白表达高于抑制剂NC（均P<0.05，图5A，5B）。与CUL2表达观察到的变化直接相反，转染miR-154-5p模拟物的细胞中pRb的表达高于模拟NC，而转染miR-154-5p抑制剂的细胞中pRb的表达低于抑制剂NC（两者均P<0.05，图5C，5D）。此外，Pearson相关分析显示CUL2和pRb表达呈负相关（r=-0.879，P<0.001，图5E）。

 

CUL2敲除抑制SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭，并增加pRb的表达

将CUL2-siRNA转染SiHa细胞，观察其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。荧光显微镜检测显示转染效率超过90%（图6A）。Western  blot分析显示，转染CUL2 siRNA的细胞在转染72小时后，与siRNA  NC相比，CUL2蛋白水平显著降低（P<0.001，图6B，6C）。在转染CUL2  siRNA后的48h和96h，CUL2蛋白敲除降低了SiHa细胞的增殖（均P<0.05，图6D）。此外，与转染后48小时的siRNA-NC相比，CUL2-siRNA显著抑制SiHa细胞的迁移（P<0.05，图6E，6F）。与siRNA  NC相比，CUL2  siRNA组中SiHa细胞的侵袭能力降低了46.34%（P=0.0112，图6G，6H）。在用CUL2-siRNA转染SiHa细胞72小时后，pRb的表达高于siRNA-NC（P<0.05，图6I，6J）。

 

研究结论

研究表明miR-154-5p通过靶向CUL2  3'UTR在抑制HPV16-E7介导的pRb降解中起着关键作用，这提示miR-154-5p是治疗HPV诱发宫颈癌的潜在靶点。

 

北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。