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文献解读 | miR-203靶向Runx2抑制异位骨化!

来源:小博发布时间:2020-07-29

本期介绍一篇骨异化相关的高通量miRNA文章,发表在Cell Death and Disease, 影响因子5.72。骨异化研究方向的小伙伴可以参考下,文章不是最近的,但可以作为“骨异化+高通量检测”这类组合研究的入门案例。经检索,骨异化方向的高通量文章并不是很多,只有少量的mRNA和miRNA研究。因此,在骨异化研究领域可以尝试与mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和单细胞等层面相结合,进一步拓宽研究面!

 

研究背景

异位骨化症(HO)是临床上具有破坏力的并发症,定义为通常不发生骨骼的软组织中存在片状骨。尽管HO可能由骨化性纤维增生症(FOP)引起,但通常在骨折和脱位后发现。HO经常出现在关节周围的软组织内,导致关节僵硬、神经束缚和持续性疼痛。虽然HO的发病机理尚不清楚,但已经确定了可能导致此过程的几个因素,如成骨细胞的不当增殖和分化促进了骨的形成。此外,已发现很多的miRNA可以调节成骨分化标记基因的表达,但它们在HO病理生理机制中的功能作用仍有待确定。

 

样本选择及差异筛选

  • 分组及样本:正常组和HO组,骨组织样本,每组5个重复,共10个样本。正常骨组织取自正常人的外伤截肢。

  • 基因芯片检测:文中采用基因芯片进行miRNA和mRNA的表达量检测。

  • 差异筛选及PCR验证:与正常骨组织相比,HO组织的miR-203水平显着降低。此外,通过PCR检测了15个正常骨组织样本和30个HO组织中Runx2 的表达水平,结果发现Runx2在HO组织样品中显着上调。最后,通过线性回归发现HO样品中Runx2 与miR-203表达之间存在显着的负相关关系。

 

 

功能研究——确认Runx2是miR-203的直接靶标!

先前的研究表明,β-catenin和细胞外信号调节激酶(ERK)通过参与Runx2相关通路来参与骨形成。miR-203过表达后显着降低了Runx2,β-catenin和p-ERK的水平。相反,miR-203敲降后会增加Runx2,β-catenin和p-ERK蛋白的水平。miR-203对Runx2 mRNA表达有影响,但是不影响β-catenin(CTNNB1基因)和ERK(MAPK1基因)mRNA表达。

 

机制研究——miR-203具体是怎么作用的?

为了研究miR-203是否通过Runx2调节β-catenin和ERK信号传导,将hFOB1.19细胞与Runx2 siRNA和antagomiR-203共转染,结果发现Runx2敲低可抑制antagomiR-203激活ERK和β-catenin。然后将hFOB1.19细胞与Runx2过表达质粒和agomiR-203共转染,结果表明Runx2的重新表达挽救了agomiR-203的抑制作用。这些数据表明miR-203以Runx2依赖性方式抑制ERK和β-catenin信号传导。

接下来,使用Targetscan和miRBase预测miR-203和Runx2的靶向结合关系,发现在Runx2 mRNA的3'-非翻译区(UTR)中确定了miR-203的四个miRNA调控元件(MRE)(P1-P4)。将这四个部分3'-UTRs分别克隆到荧光素酶开放阅读框下游的pGL3报告载体中,结果发现,用P1荧光素酶报告基因加miR-203转染的细胞表现出明显更低的荧光素酶活性。此外,还发现agomiR-203对荧光素酶活性的抑制是剂量依赖性的。为了证明miR-203的特异性,转染miRNA抑制剂antagomiR-203特异性地消除了荧光素酶活性。接着,构建一个包含miR-203-结合位点突变序列(MUT-Runx2-3'-UTR)的Runx2 3'-UTR荧光素酶报告基因,并用agomiR-203或agomiR-NC转染了hFOB1.19细胞,结果发现,miR-203的过表达抑制了Runx2 3'-UTR报告基因的荧光素酶活性,而序列内的突变则消除了这种抑制作用。

 

为了研究miR-203在成骨细胞分化中的作用,分别用agomiR-203或antagomiR-203转染hFOB1.19细胞以分别过表达或敲降miR-203,然后在成骨诱导培养基(OM)中进行培养。染色实验显示,miR-203的过表达抑制了成骨细胞的成骨分化,而miR-203的敲降则促进了成骨分化过程。为了阐明成骨细胞分化过程中miR-203的表达特征,将hFOB1.19细胞在OM中培养21天,在此成骨过程中,miR-203的表达逐渐降低。此外,从成骨细胞分化开始,Runx2,β-catenin和p-ERK蛋白水平强烈增加,并一直保持高水平直至第21天(矿化阶段)。agomiR-203转染可降低Wnt 3a的表达水平,而antagomiR-203处理可增强Wnt 3a的表达。Runx2 siRNA转染后可显着降低成骨标记基因ALP,BSP和OCN的mRNA水平。此外,Runx2 siRNA转染完全阻断了miR-203的作用,这表明miR-203在成骨细胞分化中的功能是Runx2依赖性的。(细胞水平)

临床HO样品显示Runx2表达升高,β-catenin和ERK信号激活。从肘部创伤患者中切除HO病变,并以正常骨骼作为对照。将所有骨头脱矿质并进行免疫组织化学测定,结果发现,与正常骨骼相比,HO组织中Runx2,β-catenin和p-ERK的表达增加,且复发性HO中的Runx2表达水平高于原发性HO。但是,原发性和复发性HO组之间的β-catenin和p-ERK表达水平没有显着差异。接下来,PCR结果表明HO组织中ALP,BSP和OCN mRNA水平升高。复发性HO组中ALP和OCN的表达水平显着较高,而BSP表达无显着差异。此外,将复发性HO组织与原发性HO组织进行比较,发现在复发性样本中miR-203表达水平较低,而Runx2表达水平较高。(临床水平)

 

为了进一步验证了miR-203是否在体内具有重要作用。小鼠进行了切腱术以产生创伤性HO模型。为了检查治疗效果,随后每周在病变部位注射agomiR-203或antagomiR-203(80 mg / kg)对小鼠进行治疗。磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照。用agomiR-203治疗的小鼠的HO显著低于NC组,而antagomiR-203治疗则增加了HO的体(图6a和b)。此外,使用agomiR-203治疗的小鼠的HO组织的miR-203水平升高,而用antagoomiR-203治疗的miR-203水平降低。收集HO损伤并进行免疫组化测定,发现agomiR-203治疗后Runx2,β-catenin和p-ERK的表达降低,而antagomiR-203治疗后其表达增加。(动物水平)

 

五.最后的结论

研究发现在创伤性HO模型中,agomiR-203的药物治疗可有效减少骨骼外骨骼的形成。此外,miR-203是通过抑制其靶标Runx2的转录后水平来发挥相应功能。

参考文献:miR-203 inhibits the traumatic heterotopic ossification by targeting Runx2.

 


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