根据题目，顾名思义，本次内容其实是围绕口腔领域的五指山小型猪动物模型展开的相关研究，涉及表达谱研究、甲基化研究和非编码RNA的研究。这个系列中包含3篇文章，它们的实验设计都是一样的，不同的是：在相同的样本基础上开展不同层面的研究，这一点还是比较值得借鉴！ 该系列中模型、样本、分组信息均如下：动物模型：五指山小型猪下颌第三乳磨牙胚作为研究对象实验分组：E40、E50、E60三个时期的牙胚，每个时期三个生物学重复 今天呢，主要介绍基于此设计下表达谱的相关研究，全面展示下以猪这样的小物种为动物模型是如何通过高通量检测和数据分析一步步开展mRNA在牙胚发育中作用的研究！ 研究背景：牙齿再生是口腔医学及再生医学的研究热点，基于细胞重组发育学原理是目前比较热的全牙再生方式。小型猪牙齿的大小、形态、数量、发育周期和双牙列替换等方面都与人类高度相似，是研究牙齿发育较为理想的动物模型。五指山小型猪（明星动物模型，中国自主知识产权，消化系统、呼吸系统、心血管系统、泌尿系统、生殖系统、内分泌系统和免疫系统等的解剖和组织学研究都有应用，这是小编百度的）是其中模型之一，这篇文章是筛选五指山小型猪牙齿发育过程阶段的关键mRNA。 论文题目：Stage-specific differential gene expression profiling and functionalnetwork analysis during morphogenesis of diphyodont dentition in miniaturepigs, Sus Scrofa，发表在BMC Genomics (IF=3.5)上。
样本选择：研究牙齿发育，首先先定位牙齿更新发育过程中的几个阶段进行选材，而且时间点选择要经典，要有典型代表性。本实验采用五指山小型猪下颌第三乳磨牙胚作为研究对象，获取不同孕期的小型猪胚胎，选取胚胎E40、E50、E60（这里的E后面数字是天数），其分别对应帽状期、钟状期和钟状晚期分泌期。下颌第三乳磨牙胚在下颌牙列中发育较早，定位比较准确，发育时比较典型，非常适合做牙齿发育学的研究。 初步探索：E40、E50、E60三个时期的牙胚，每个时期三个生物学重复，提取Total RNA，进行猪的全基因组表达谱芯片（Affymetrix GeneChip®Porcine Genome Arrays，市场上一款猪的表达谱芯片）杂交，解析猪的所有mRNA表达量。不同阶段的牙胚进行差异基因比较筛选，分别E50 vsE40, E60 vs E50,E60 vs E40（差异筛选阈值是P＜0.05,FC＞2），图中分别用韦恩图、柱状图做了不同阶段的差异基因数量统计，E60 vs E50差异比较少，三者间差异基因的交集有110个，并集基因有2035个。
后期筛选：如何进一步定位牙齿发育过程中的关键基因呢？该文作者主要使用了深入生物信息学分析的手段。分别从基因功能、基因通路、基因表达趋势、基因网络四个层面联合着手，定位发育过程中的关键通路和基因。1、将并集的2035个基因，分别进行功能和通路的显著性富集，取前20的功能和通路展示，细胞黏附、染色体修饰、信号转导、mRNA加工、牙齿矿化以及上皮细胞有关的Wnt和BMP功能均在前列。ECM受体、氨基酸代谢、PPAR通路、TGF-beta、MAPK通路都也在前列，阐述了再生齿发育过程中关键功能及通路的变化。
2、对2035个基因进行趋势分析，前4个P值小于0.05显著的趋势均是在E40，E50，E60趋势持续下降（4, 7, 8, 13），同时做了该4个趋势内基因的功能富集分析，趋势内基因主要参与细胞粘附有关、牙齿发育、细胞极性保持、上皮向间质转化、BMP信号通路、牙齿矿化、器官形态形成等，与预期基本一致，确定了E40，E50，E60下调的基因是占据主导的作用，进一步缩小了基因的研究范围。
3、显著性通路比较多，包含基因也多，研究范围还是较大。通过构建通路之间的网络（Pathway-Network）确定核心的信号通路。凋亡、MAPK通路、细胞黏附、细胞周期、P53、细胞骨架位于Degree值TOP前列，均为较核心的通路。再挑选参与核心通路的151个基因进行基因全局转导网络的构建，网络内核心基因都是整合素家族有关的基因，与ECM受体通路关联，在牙齿发育过程中发挥了非常大的作用。
4、关键基因（ABMN、DSPP、BMP2、TGFβ2、MMP25等）进行qPCR和免疫组化验证，趋势一致。
思路汇总：通过思路图再回顾下整个流程，从前期样本收集—表达谱检测—数据分析挑选出关键的通路和基因—后期实验验证。
研究结论：通过对五指山小型猪早期不同阶段牙胚的研究，定位了牙齿发育过程中的关键的通路和基因，更有利于理解大型动物的牙齿发育过程，从而为研究人类牙齿替换机制打下基础。
PS: Affymetrix GeneChip®Porcine Genome Arrays，是一款猪的表达谱芯片，包含23937探针集，23256个转录本，20201个基因，重复性好，是研究猪基因表达的利器！！！当然还有其他小物种也都有。
北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。
