合作单位：荷兰癌症研究所、萨克勒医学院、Navarra健康研究所
中康博提供部分数据分析：差异分析、功能富集分析、GSEA分析、TCGA肿瘤数据分析
推荐语：与荷兰癌症研究所合作在国际学术期刊《Nucleic Acids Research》上在线发表了一篇致癌基因诱导的衰老相关lncRNA的研究论文。致癌基因诱导的衰老（OIS）被认为是一种重要的肿瘤抑制机制。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200 nt而没有蛋白质编码能力的转录物，表现出肿瘤抑制和致癌功能。本研究试图采用细胞衰老的细胞系统来鉴定与衰老相关的lncRNAs。首先采用转录组学鉴定了癌基因诱导后的一些差异表达的lncRNA。接下来，进行功能筛选，发现在OIS中需要表达诱导致癌应激之一的lncRNA-OIS1 。然后进一步实验证明lncRNA-OIS1是通过调控附近具有肿瘤抑制活性的DPP4基因来介导OIS过程。总的来说，本研究提供了一种新的lncRNA介导的调控通路，用于OIS期间调控DPP4。同时也支持了lncRNA作为转录调节因子在细胞衰老和癌症过程中的作用。
研究结果
为了鉴定在OIS中发挥作用的lncRNA，研究采用了表达hTERT和4-OH-他莫昔芬（4-OHT）-诱导型致癌H-RasV12的原代人BJ成纤维细胞模型，即BJ / ET / RasV12ER细胞。在衰老细胞和非衰老对照细胞中进行了RNA测序（RNA-seq），揭示了衰老相关的差异性lncRNA。 核糖体谱分析证实了这些RNA的非编码性质。研究还通过qRT-PCR证实了H-RasV12诱导后一些lncRNA的表达水平。
2、OIS过程中关键 lncRNA-OIS1的确定
为了研究OIS中lncRNA可能的作用，开发了RNAi工具来靶向在OIS中差异表达的40个lncRNA。首先生成了一个由5种不同shRNA针对每种lncRNA组成的合并文库，其中包括4种非靶向shRNA作为阴性对照，以及2种shRNA针对BRD7的阳性对照（一种在OIS中被鉴定为肿瘤抑制的基因）。 我们用shRNA文库的3个独立逆转录病毒库转导细胞，随后收获每个细胞群的一半作为对照（T0，时间0）；4-OHT处理4周培养剩余的细胞，然后收获细胞（T4，时间4周），然后进行NGS以鉴定与最初库（T0）相比富集最终群体（T4）的shRNA。结果筛选到针对BRD7的阳性对照shRNA以及在RAS诱导的细胞群富集的少数差异shRNA，表明这些lncRNA的敲低赋予表达RasV12的BJ / ET细胞的生长优势。
为了进一步验证，我们选择了两个Lnc：lncRNA＃32和lncRNA＃30。通过使用单独的shRNA重复OIS实验来验证筛选结果，增殖测定实验表明靶向lncRNA＃30的一个shRNA（＃30-5）和靶向lncRNA＃32的两个shRNA（＃32-2和＃32-3）能避开癌基因诱导的细胞停滞旁路。为了进一步检查OIS中lncRNA＃30和＃32敲低的影响，检测了与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的诱导作用。与阴性对照细胞相比，lncRNA＃30-5和lncRNA＃32-2和＃32-3细胞中观察到SA-β-Gal显着降低。相比之下，shRNA（＃30-3）没出现预期的结果。RNA表达分析表明，只有＃30-5，＃32-2和＃32-3 shRNA对它们的lncRNA靶向有效，表明靶向活性。总之，这些结果表明lncRNA＃32既被致癌性RAS诱导也是OIS表型建立所需的非编码RNA。为简单起见，在下文中将lncRNA＃32称为lncRNA-OIS1。
3、lncRNA-OIS1敲低后消除了OIS基因表达特征
接下来，进一步探索lncRNA-OIS1在衰老过程中的作用模式。为此，首先将针对lncRNA-OIS1，阳性对照p53和BRD7以及阴性对照的shRNAs导入细胞，并对这些细胞样本进行表达谱测序（RNA-seq），比较阴性对照和p53kd细胞在致癌RAS（前者进入衰老而后者绕过它）过程中的基因表达谱，结果鉴定了885个差异表达基因（与阴性对照相比，衰老细胞中386上调和499下调）。功能富集分析表明，与p53kd细胞相比，在衰老细胞中表达明显受抑制的基因组显着富集于细胞周期相关基因(功能富集分析)，反映了在阴性对照中强烈的细胞致癌应激导致的增殖停滞。细胞周期基因的急剧下调是诱导衰老状态的分子标记。敲低lncRNA-OIS1显着消除了这些基因的抑制状态。lncRNA-OIS1-kd的影响与BRD7-kd获得的效果相当，但弱于p53-kd引起的影响。根据OIS旁路的表型效应，发现lncRNA-OIS1-kd导致CDKN1A（p21）的诱导减弱，CDKN1A（p21）是BJ细胞中OIS所需的p53的主要靶标。以上结果证明了由于lncRNA-OIS1引起的CDKN1A表达降低的特异性KD。
为了进一步研究敲低lncRNA-OIS1对细胞转录组的作用，使用GSEA分析比较了诱导致癌RAS细胞（转染有针对lncRNA-OIS1的shRNA或用非靶向shRNAs的细胞）中的基因表达谱。如预期一样，敲低lncRNA-OIS1后上调最强的基因与增殖和细胞周期有关。响应于电离辐射诱导，在lncRNA OIS1kd细胞中最显着下调的基因中，包含许多p53直接靶基因，这表明lncRNA-OIS1的敲低损害了p53网络的活化。此外，在lncRNA-OIS1 kd细胞中氧化磷酸化通路相关基因也下调。这些数据表明lncRNA-OIS1的敲低消除了OIS基因表达特征。
4、lncRNA-OIS1敲低后抑制了OIS对DPP4的诱导作用
为了研究lncRNA-OIS1对 OIS诱导的调控机制，首先检查其亚细胞定位。 在对照BJ / ET / RasV12ER细胞中，lncRNA-OIS1位于细胞核和细胞质中。 在RASV12激活后，lncRNA OIS1在这两个区室中保持相似的模式。 ISH分析证实lncRNA-OIS1在RASV12诱导后表达增加，并且在细胞核和胞质溶胶中的定位。此外，在原代BJ细胞中过表达lncRNA-OIS1，但BrdU标记和SA-β-Gal测定结果未观察到衰老的诱导。其次，在lncRNA-OIS1-kd细胞中过表达lncRNA-OIS1并未能恢复衰老表型。这些数据表明lncRNA-OIS1在反式作用中不起作用，而是需要局部表达和对邻近基因的作用（顺式作用）。
为了进一步研究lncRNA-OIS1是否真的影响附近的基因，分析了衰老和增殖BJ细胞的GRO-Seq数据，结果发现在RAS诱导时BJ细胞中lncRNA-OIS1及其附近的基因DPP4均增加，同时在TIG3细胞中也观察到相同的效应。另外，基于BJ细胞RNA-seq数据，lncRNA-OIS1的敲低消除了癌基因诱导后DPP4的活化，并通过qRT-PCR验证了这些结果。然后选择在RASV12诱导4天后， DPP4的蛋白质印迹实验确定了最佳两个lncRNA-OIS1敲低（KD2和4）建立起来的衰老模型。这些数据将lncRNA-OIS1与调控DPP4表达以及致癌RAS诱导的衰老表型联系起来。
5、 DPP4敲低后绕过OIS过程
假设DPP4的肿瘤抑制作用与OIS有关。为了研究这个问题，构建DPP4敲低的BJ细胞。 qRT-PCR和蛋白质印迹实验结果表明敲低后DPP4 mRNA和蛋白水平显着降低。如预测的那样，增殖和SA-β-Gal测定实验结果表明，DPP4的缺失后绕过了OIS。接下来，进一步研究lncRNA-OIS1是否通过DPP4调节衰老。将DPP4克隆到慢病毒载体中，在lncRNAOIS1-kd细胞中异位表达并诱导OIS。有趣的是，增殖（BrdU标记）和SA-β-Gal测定表明DPP4的异位表达消除了lncRNA-OIS1-kd细胞的衰老旁路表型，而对照载体没有。这些实验表明在OIS期间DPP4是lncRNA-OIS1的相关靶基因，并且lncRNA-OIS1是OIS中DPP4功能的主要决定因素。
6、LncRNA-OIS1和DPP4在肿瘤中的相关性研究
最后，通过TCGA数据库分析，研究了肿瘤中的lncRNA-OIS1表达及其与DPP4的相关性。LncRNA-OIS1在大多数肿瘤类型中表达量很低。 研究绘制了lncRNA-OIS1在正常和肿瘤样本中的读数，在每种类型中指示了至少一个读数为lncRNA-OIS1的样本数。 有趣的是，前列腺腺癌（PRAD）样品表现出清晰的lncRNA-OIS1表达，并该数据集进行差异表达分析，发现肿瘤和正常样本之间没有变化（P= 0.28），但在肿瘤样品中lncRNA-OIS1和DPP4之间呈显着正相关（r = 0.469，P= 2.5e-31），表明至少在PRAD中DPP4表达受lncRNA-OIS1调制。
lncRNA-OIS1的研究示意图
文章总结：本研究通过描述lncRNA-OIS1在由OIS诱导的细胞衰老中的作用来理解lncRNAs的功能。OIS诱导后lncRNA-OIS1上调是诱导DPP4（一种具有肿瘤抑制活性的基因）所需的。 lncRNA-OIS1敲低细胞的差异表达分析表明OIS诱导后CDKN1A的活化减弱，细胞周期调控基因的变化促进了细胞增殖。基因互补实验表明，lncRNA-OIS1邻近基因DPP4是lncRNA-OIS1在衰老过程中的下游靶点。究竟DPP4如何影响CDKN1A和细胞周期基因，以及lncRNA-OIS1如何控制DPP4表达，仍有待发现。尽管如此，研究在此描述了lncRNAs的一个重要功能，可能对癌症生物学产生潜在的影响。
PS: 中康博可提供文中涉及的高通量RNA-seq检测及数据分析服务！
参考文献：LncRNA-OIS1 regulates DPP4 activation to modulate senescence induced by RAS. Nucleic Acids Research. 2018.
北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。