推荐语：CircRNA是一类特殊的非编码RNA分子,也是RNA领域最新的研究热点，它介导的生物学已经牵涉于许多细胞过程。4月3日，中科院生物物理所范祖森教授与王硕研究员在国际学术期刊《Immunity》上在线发表了一项名为< A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion >的最新研究论文，首次发现了一个新的非编码环状RNA—— Cia-cGAS, 定位于细胞核中，可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。本文结构严谨，逻辑清晰，是研究circRNA的典型参考。

文章概述：本文通过高通量circRNA检测筛选出与造血干细胞干性维持相关的关键circRNA分子，通过RNA干扰实验进一步验证并确定了研究对象Cia-cGAS。通过敲除内含子反向互补序列的策略构建了Cia-cGAS的敲除小鼠模型，验证了Cia-cGAS在造血干细胞中的功能。基于RNA Pull-down，RIP， FISH共定位及EMSA实验筛选并验证出靶标分子cGAS。最后酶学功能研究证明，Cia-cGAS与cGAS相互作用能够抑制cGAS的活性。
 

Cia-cGAS调控模式图


研究结果
1、 circRNA研究对象的确定（Cia-cGAS）
为探索造血干细胞功能相关的circRNA分子，作者比较了小鼠的各种造血干细胞中全转录组的变化情况，找出了156种存在明显表达差异的circRNA分子，其中49种在LT-HSC中表现为上调。RNase R消化后QPCR分析其中有9种验证为明确在LT-HSC中表达上调的circRNA。为有效筛选到与造血干细胞功能有关的circRNA分子，通过shRNA干扰实验， 发现只有干扰Cia-cGAS后才能明显影响造血干细胞的亚群分布。因此，本文的研究对象确定为Cia-cGAS分子。

测序筛选HSC相关circRNA分子

干扰circRNA后对HSC亚群的影响分析

2、Cia-cGAS的基础研究（表达、保守性、定位等）
确定circRNA研究对象后，进一步分析Cia-cGAS的组织表达，进化保守性，亚细胞定位等基本信息，发现Cia-cGAS是个高表达、高保守、位于胞核的环状RNA。

Cia-cGAS的组织表达和进化保守性分析

3、Cia-cGAS与其宿主基因的比较研究
Cia-cGAS由D430042O09Rik基因反向剪切形成，那么上述的表型会不会是线性RNA的作用呢？研究结果发现shRNA并不对线性RNA起作用，且D430042O09Rik位于胞质而Cia-cGAS位于胞核。此外，专门针对线性D430042O09Rik的shRNA并不影响造血系统的亚群分布，但同时针对线性和环形RNA的干扰RNA则能明显影响造血干细胞亚群分布。

仅有Cia-cGAS干扰后才影响HSC亚群分布

4、Cia-cGAS的功能表型研究
4.1 如何构建Cia-cGAS敲除小鼠？
通过上述的实验， Cia-cGAS是影响造血干细胞功能的关键，其线性基因D430042O09Rik没有这一功能，因此如何构建特异性敲除Cia-cGAS是进一步探索其功能的关键。Cia-cGAS是由其宿主基因D430042O09Rik的4~6号外显子环化形成的，它的敲除策略是敲除下游内含子中反向互补序列相关的片段。

Cia-cGAS敲除方案设计

在构建基因敲除的小鼠之前，作者首先针对D430042O09Rik基因对应的内含子序列设计了迷你基因系统，分析与Cia-cGAS生成相关的内含子序列片段，结果证明在外显子4上游和外显子6下游的内含子中存在的反向互补序列是形成Cia-cGAS的关键，敲除下游的反向互补序列能够实现特异性敲除Cia-cGAS。

迷你基因验证与Cia-cGAS生成有关的反向互补序列

4.2 Cia-cGAS敲除小鼠模型的功能表型如何？
Cia-cGAS敲除小鼠模型构建成功后，分析了造血干细胞的亚群分布等基本特征，结果表明敲除小鼠中LSK细胞明显增多，LT-HSC明显减少，这些小鼠出生6个月左右便死于贫血。Cia-cGAS敲除小鼠的LT-HSC的BrdU染色阳性率明显高于对照组，说明敲除小鼠中LT-HSC细胞处于活跃的增殖分裂活动。作者还通过脉冲标记H2B-GFP的小鼠模型分析了敲除小鼠中LT-HSC处于静息或活化状态的比例，结果也显示Cia-cGAS敲除后LT-HSC细胞处于明显的活跃状态，静息状态的比例显著降低。
 

Cia-cGAS敲除后LT-HSC细胞静息状态减少

同时，表达谱检测和GSEA分析还发现Cia-cGAS敲除后I型干扰素IFNs的分泌升高，差异分子多集中在干扰素反应基因上。

Cia-cGAS敲除后I型干扰素的分泌增高

5、 Cia-cGAS的分子机制研究

关键点：如何筛选和鉴定Cia-cGAS的靶标分子？
文中策略是首先通过RNA Pull-down初步筛选出靶标分子，然后进一步验证。circRNA的RNA Pull-down是非常有挑战性的实验，目前报道的数量还不多。作者的做法是先通过表达线性的Cia-cGAS进行初筛，然后进一步基于RIP和环形RNA的 RNA Pull-down验证，进一步通过突变分析相互作用的相关序列信息。
将circRNA的序列线性化表达，反义链作为对照，钓取的蛋白跑胶后银染，然后找出变化明显的条带质谱鉴定。通过这种方法，作者找到了cGAS蛋白。进一步通过抗cGAS抗体的RIP实验证明了cGAS与Cia-cGAS的确有相互作用。免疫荧光+FISH实验，进一步验证了这一相互作用。基于电泳迁移率改变实验（EMSA），作者通过构建Cia-cGAS的突变体，分析了相互作用的位点和片段信息。
 

筛选和鉴定Cia-cGAS的相互作用分子

同时，酶学实验证明Cia-cGAS结合cGAS能抑制cGAS的功能，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。

研究结论

LT-HSC中Cia-cGAS结合并抑制cGAS的活性，Cia-cGAS敲除可导致LT-HSC中I型IFN升高。Cia-cGAS可以保护静息状态的LT-HSC免受因cGAS持续活化而导致的细胞资源耗竭。Cia-cGAS是cGAS介导的识别和自身免疫应答的有效抑制剂。